Pembuatan Media Kultur Jaringan Tanaman

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Teknik kultur jaringan tanaman merupakan cara yang berguna untuk belajar dasar dan aplikasi pemeliharaan dan perbanyakan tanaman khususnya untuk bioteknologi. Kultur jaringan tanaman dengan luas mengacu kepada pengolahan bagian tanaman secara in vitro. Teknik ini banyak digunakan sebab teknik ini sederhana dan lebih mudah untuk pengamatan suatu tanaman.

Beberapa cara memperoleh tanaman untuk menggunakan teknik kultur jaringan yaitu mengambil bagian kecil dari suatu tanaman. Metode ini juga disebut perbanyakan mikro (micro propagation). Tanaman memerlukan nutrisi dan vitamin untuk dapat tumbah pada teknik kultur jaringan tanaman.
Biasanya setiap tanaman mempunyai kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhannya. Inti dari teknik kultur jaringan yaitu menyediakan nutrisi dengan media yang tepat untuk pertumbuhan eksplan. Masa kini banyak media yang dibuat khusus untuk penyediaan nutrisi bagi eksplan, salah satunya yaitu media MS (Murashige and Skoog) yang merupakan median yang paling banyak digunakan untuk teknik kultur jaringan.

B. Tujuan

Praktikum kultur jaringan tanaman acara pembuatan media bertujuan untuk:
1. Mengetahui media yang digunakan dalam kultur jaringan
2. Mengetahui cara membuat media MS
3. Mengetahui bahan-bahan yang digunakan dalam membuat media MS

II. TINJAUAN PUSTAKA

Kultur jaringan merupakan suatu rangkaian prosedur untuk memelihara dan menumbuhkan sel tanaman (dapat berupa kalus, sel, protoplas) dan organ (batang, akar, embrio) secara aseptik. Aseptik disini berarti bebas dari kontaminasi mikroba.

Tujuan utama kultur jaringan tanaman yaitu untuk perbanyakan bagian tanaman. Perbanyakan dapat dilakukan dengan cara merangsang pertumbuhan tunas cabang dan percabangan aksiler atau merangsang terbentuknya tunas pucuk tanaman secara adventif, baik secara langsung maupun kalus terlebih dahulu. Bagian-bagian tanaman dapat tumbuh secara optimal apabila menggunakan media tepat yang digunakan untuk pemenuhan nutrisi tanaman. Media yang digunakan harus mengandung mineral, gula, vitamin dan hormon dengan perbandingan yang dibutuhkan secara tepat. Media perlu ditambahkan agar untuk mendapatkan media semi padat yang fungsinya untuk meletakkan atau membenamkan jaringan tanaman (Wetherell, 1976).

Menurut Prakash et al. (2004), pertumbuhan tanaman in vitro sebagian besar dipengaruhi oleh komposisi media kultur. Komponen media yang utama dalam kultur jaringan tanaman yaitu garam, mineral dan gula sebagai sumber karbon dan air. Komponen lain merupakan tambahan organik, pengatur pertumbuhan, gell agar. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan antara lain Murashige dan Skoog (MS), Linsmaier dan Skoog (LS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dan lain-lain. Meskipun beberapa jumlah komposisi dirubah untuk langkah-langkah kultur jaringan dan spesies tanaman berbeda, media MS (Murashige dan Skoog, 1962) dan LS (Linsmaier dan Skoog, 1965) paling banyak digunakan dalam kultur jaringan tanaman.

Setiap unsur yang terkandung dalam media mempunyai fungsi bagi metabolisme tanaman atau proses kultur jaringan. Media yang digunakan untuk kultur sel dalam bentuk larutan nutrisi, padat dan cair. Media MS sebagai media fundamental yang mengandung nutrisi makro anorganik, nutrisi mikro anorganik, nutrisi Fe, vitamin, organik dan zat pengatur pertumbuhan tanaman (phytohormon). Phytohormon yang paling banyak digunakan dalam kultur jaringan tanaman (khususnya media MS) yaitu (Storr, 1985):
1. Auksin : NAA, IAA dan 2,4 D
2. Sitokinin : BAP dan Kinetin
Komposisi nutrisi makro anorganik mempunyai fungsi, khususnya untuk metabolisme tanaman. Komposisi tersebut mengandung protein, karbohidrat, asam nukleat, lipid dan lain-lain. Unsur-unsur nutrisi makro anorganik dalam media MS antara lain:
1. KNO3
2. NH4NO3
3. CaCl2.H2o
4. MgSo4.7H2O
5. KH2PO4
Sedangkan unsur-unsur nutrisi mikro anorganik dalam media MS antara lain:
1. MnSO4.4H2O
2. ZnSO4.4H2O
3. H3BO3
4. Kl
Salah satu unsur Fe berasal dari komponen nutrisi mikro anorganik. Unsur Fe dikatagorikan dalam larutan stok C karena nutrisi ini tidak dapat larut dengan unsur lain. Oleh karena itu, Fe harus dipisahkan dari unsur lain.

Vitamin yang digunakan dalam media MS hanya thiamine (vitamin B1). Komponen ini diperlukan untuk metabolisme karbohidrat dan biosintesis dari asam amino. Vitamin telah terbukti sebagai komponen yang penting dalam kultur jaringan tanaman. Vitamin lain yaitu seperti vitamin C dan vitamin E hanya digunakan jika diperlukan untuk pertumbuhan eksplan maksimum. Unsur organik dalam media MS seperti sukrosa atau gula lain menambahkan ke dalam media untuk menyediakan CO2.

III. BAHAN DAN ALAT

A. Bahan
1. Larutan Stok A (nutrisi makro)
a. KNO3
b. NH4NO3
c. CaCl2.H2o
d. MgSo4.7H2O
e. KH2PO4

2. Larutan Stok B (nutrisi mikro)
a. MnSO4.4H2O
b. ZnSO4.4H2O
c. H3BO3
d. Kl
e. NaMoO4.2H2O
f. CuSO4.5H2O
g. CoCl2.6H2O

3. Larutan Stok C (nutrisi Fe)
a. FeSO4.7H2O
b. Na2EDTA 4. Larutan Stok D
a. Myo-inositol
b. Thiamine-HCl
c. Nicotinic acid
d. Pyridoxine-HCl
e. Glycine

5. Larutan Stok E (IAA)

6. Larutan Stok E (Kinetin)

7. Thiamine

8. Sukrosa

9. Asam amino

10. Akuades

11. Agar

12. HCl

13. NaOH

B, Alat
1. Stirrer magnetic
2. Stirrer
3. Plastik
4. Karet gelang
5. Alumunium foil
6. LAF ( Laminar Air Flow )
7. pH meter 8. Timbangan analitik.
9. Kompor
10. Autoklaf
11. Beaker glass
12. Pipet
13. Kertas tisu
14. Panci

IV. PROSEDUR KERJA

A. Larutan Stok A
1. Memilih dan menimbang bahan yang digunakan berdasarkan tabel yang telah disediakan.
2. Melarutkan semua bahan dalam 350 ml akuades pada beaker glass dan mengaduk menggunakan stirrer magnetic.
3. Setelah semua bahan diaduk, menambahkan akuades pada beaker glass sampai volume 500 ml
4. 100 ml larutan stok A dibutuhkan untuk membuat 1 L larutan dalam media MS.

B. Larutan Stok B
1. Memilih dan menimbang bahan yang digunakan berdasarkan tabel yang telah disediakan.
2. Melarutkan semua bahan dalam 350 ml akuades pada beaker glass dan mengaduk menggunakan stirrer magnetic.
3. Setelah semua bahan diaduk, menambahkan akuades pada beaker glass sampai volume 500 ml
4. 5 ml larutan stok B dibutuhkan untuk membuat 1 L larutan dalam media MS.

C. Larutan Stok C
1. Memilih dan menimbang bahan yang digunakan berdasarkan tabel yang telah disediakan.
2. Melarutkan semua bahan dalam 350 ml akuades pada beaker glass. Mengaduk dan memanaskan dengan stirrer untuk melarutkan unsur tersebut.
3. Setelah semua bahan diaduk, menambahkan akuades pada beaker glass sampai volume 500 ml
4. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam botol dan ditutup menggunakan alumunium foil supaya terhindar dari cahaya matahari langsung.
5. 50 ml larutan stok C dibutuhkan untuk membuat 1 L larutan dalam media MS.

D. Larutan Stok D
1. Memilih dan menimbang bahan yang digunakan berdasarkan tabel yang telah disediakan.
2. Melarutkan semua bahan dalam 350 ml akuades pada beaker glass dan mengaduk menggunakan stirrer magnetic.
3. Setelah semua bahan diaduk, menambahkan akuades pada beaker glass sampai volume 500 ml
4. 5 ml larutan stok B dibutuhkan untuk membuat 1 L larutan dalam media MS.

E. Larutan Stok F
1. Larutan stok E (sitokinin) dapat membuat 1 mg l-1 Kinetin.
2. Melarutkan bubuk menggunakan HCl dalam 350 ml akuades pada beaker glass dan mengaduk menggunakan stirrer magnetic.
3. Ketika sudah larut, menambahkan akuades sampai volume 500 L dan mengaduk menggunakan stirrer.
4. Larutan stok F harus disimpan dalam pendingin (5oC)
5. 1 ml larutan stok B dibutuhkan untuk membuat 1 L larutan dalam media MS.

F. Pembuatan MS Media
1. Melarutkan semua larutan yang dibutuhkan dari media MS untuk setiap larutan stok
2. Ketika semua unsur sudah larut, tambahkan 30 gr sukrosa dan tambahkan volume dengan akuades sampai 900 ml kemudian aduk menggunakan stirrer.
3. Mengecek pH menggunakan pH meter.
4. Jika pH kurang dari 5,8 tambahkan NaOH sampai pH mencapai 5,8
5. Jika pH lebih dari 5,8 tambahkan HCl sampai pH mencapai 5,8
6. Masak media yang telah siap dengan ditambahkan 8 gr agar bubuk sampai mendidih
7. Memasukkan media yang telah mendidih ke dalam botol kultur dan ditutup menggunakan plastik.
8. Media di autoklaf pada 121oC-126oC selama 15 menit.
9. Media yang sudah di autoklaf disimpan dalam rak inkubasi.

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

1. Larutan Stok A (nutrisi makro)
a. KNO3
b. NH4NO3
c. CaCl2.H2o
d. MgSo4.7H2O
e. KH2PO4

2. Larutan Stok B (nutrisi mikro)
a. MnSO4.4H2O
b. ZnSO4.4H2O
c. H3BO3
d. Kl
e. NaMoO4.2H2O
f. CuSO4.5H2O
g. CoCl2.6H2O

3. Larutan Stok C (nutrisi Fe)

FeSO4.7H2O

Na2EDTA

4. Larutan Stok D

Myo-inositol
Thiamine-HCl
Nicotinic acid
Pyridoxine-HCl
Glycine

5. Larutan Stok E (IAA)
6. Larutan Stok E (Kinetin)
7. Thiamine
8. Sukrosa 6%
9. Asam amino
10. Akuades
11. Agar
12. HCl
13. NaOH

B. Pembahasan

Tahun 1962 Murashige dan Skoog memperkenalkan hasil temuannya berupa komposisi media kultur yang terdiri dari unsur makro, unsur mikro, vitamin dan asam amino pada konsentrasi tertentu. Temuan ini dikenal dengan nama media Murashige dan Skoog (MS). Media MS (Murashige dan Skoog) merupakan media universal yang paling umum digunakan pada kegiatan kultur jaringan tanaman.

Praktikum pembuatan media kali ini menggunakan media MS. Media MS yang dibuat mengandung nutrisi makro anorganik, nutrisi mikro anorganik, nutrisi Fe, vitamin, organik dan zat pengatur tumbuh tanaman (phytohormon). Komposisi nutrisi makro yang digunakan adalah:
1. KNO3
2. NH4NO3
3. CaCl2.H2O
4. MgSO4.7H2O
5. KH2PO4
Komposisi ini mengandung : N (KNO3 dan NH4NO3); K (KNO3 dan KH2PO4); P ( KH2PO4), Ca (CaCl2.H2O); Mg (MgSO4.7H2O) dan S ( MgSO4.7H2O) unsur kimia ke dalam pertumbuhan tanaman. Unsur nitrogen ditambahkan dalam jumlah besar dibandingkan dengan unsur yang lain karena tanaman membutuhkan nutrisi tersebut dalam jumlah besar untuk pertumbuhan vegetatif (Prakash et al, 2004).
Nutrisi mikro yang digunakan dalam praktikum kali ini dalam bentuk nutrisi stok B yaitu MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3 and KI. Nutrisi mikro dalam kultur jaringan tanaman menggunakan konsentrasi molar yaitu Fe, Mn, Zn, B, Cu dan Mo. Fe dapat diperoleh dari larutan stok C karena unsur ini sangat reaktif dengan unsur lain dan cahaya.

Vitamin dibutuhkan untuk pertumbuhan dan pengembangan untuk tanaman sintesis seperti karbohidrat dan asam nukleat. Thiamin semestinya harus digunakan dalam pembuatan stok vitamin atau disebut juga larutan stok D. Komponen ini diperlukan pada konsentrasi yang sangat rendah.
Phytohormon yang digunakan adalah kinetin dengan rasio 1: 1. Rasio pada phytohormon determinen untuk divisi sel dan formasi kulit yang tebal dan keras. Membuat larutan stok harus dilarutkan kinetin dengan NaOH (untuk IAA) dan HCl (untuk kinetin).

Agar dan gula diperlukan untuk pembuatan media. Bubuk agar perlu untuk media pembuatan menjadi semi padat. Diperlukan pemanas untuk mencairkan bubuk agar dan media MS cair sampai mendidih. Gula berfungsi ganda di dalam media yaitu berfungsi sebagai sumber energi dan sebagai penyeimbang tekanan osmotik media. Menurut George & Sherrington (1984) dalam Anonim (2009), 4/5 bagian dari potensial osmotik dalam media White disebabkan oleh gula, sedangkan dalam media MS hanya 1/2 dari potensial osmotiknya disebabkan adanya gula.

Sebelum media dipanaskan harus diperiksa pH nya terlebih dahulu. Media sangat baik pada pH 5,8 jika pH kurang dari 5 media agar akan terlalu lemah, tetapi jika pH di atas 7 media agar terlalu padat dan tidak bisa penanaman eksplan dengan baik. Faktor penting adalah pH yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor (Anonim, 2009):
4. Kelarutan dari garam-garam penyusun media
5. Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain
6. Efisiensi pembekuan agar.
Untuk menghindarkan perubahan pH yang cukup besar. Murashige dan Skoog menyarankan agar dilakukan pemanasan untuk melarutkan agar-agar dan memanaskan media di dalam autoklaf selama beberapa menit, baru diadakan penetapan media disterilkan dalam autoklaf. Dalam wadah yang besar, media disterilkan dan kemudian dititrasi dengan NaOH/HCl steril sampai pH yang diinginkan. Setelah itu media dituang ke dalam wadah kultur steril yang telah dipersiapkan di dalam Laminar Air Flow cabinet.
Keuntungan dari pemakaian agar adalah (Anonim, 2009):
1. Agar membeku pada temperatur ≤ 45o C dan mencair pada temperatur 100o C, sehingga dalam kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil.
2. Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman.
3. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media.

Setiap jenis vitamin mempunyai fungsi yang berbeda-beda di dalam tubuh tanaman antara lain:

1. Inositol (vit. B) bagian dari berbagai macam membran (kloroplas).
2. Thyamin (vit. B1) berperan sebagai ko-enzim dari siklus krebs.
3. Nicotinic acid (niacin) berperan dalam fotosintesa.
4. Pyridoxine (vit. B6) berperan sebagai ko-enzim pada beberapa enzim.
5. Pantothenic acid (a vit. B) berperan sebagai ko-enzim dalam metabolisme lemak.
6. Riboflavin (vit. B12) berperan sebagai ko-enzim reseptor sinar biru.
7. Biotin (vit. H) berperan sebagai ko-enzim dalam metabolisme lemak.

Hormon yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah kinetin golongan dari sitokinin. Golongan sitokinin adalah turunan dari adenine. Golongan ini sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. Kinetin merupakan sitokinin yang pertama ditemukan dan diisolasi oleh Skoog dalam laboratorium Botani di University of Wisconsin. Kinetin diperoleh dari DNA ikan Herring yang diautoklaf dalam larutan yang asam. Persenyawaan dari DNA tersebut sewaktu ditambahkan ke dalam media untuk tembakau, ternyata merangsang pembelahan sel dan differensiasi sel. Persenyawaan tersebut kemudian dinamakan kinetin. Fungsi sitokinin terhadap tanaman antara lain:
1. Memacu terbentuknya organogenesis dan morfogenesis.
2. Memacu terjadinya pembelahan sel.
3. Kombinasi antara auksin dan sitokinin akan memacu pertumbuhan kalus.

Penyesuaian tanaman pada media kultur diharapkan mampu mempertahankan pertumbuhan sel tanaman dan mendorong pembelahan sel. Tanaman dapat bertahan hidup dan melanjutkan perkembangannya harus dipenuhi dengan media yang tepat serta media yang bebas dari penyakit. Media dapat bebas dari penyakit dan kontaminasi mikroba perlu disterilisasi terlebih dahulu. Alat sterilisasi yang biasa digunakan dalam kultur jaringan yaitu autoklaf. Berikut adalah langkah-langkah sterilisasi media.
1. Mengisi panci luar autoklaf dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng sebanyak 1 liter untuk autoklaf kecil dan 1.5 liter untuk autoklaf besar.
2. Botol-botol yang telah diisi media yang akan disterilisasi di masukkan ke dalam panel dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panel.
3. Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci luar
4. Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat)
5. Biarkan salah satu katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka.
6. Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar Bunsen.
7. Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap.
8. Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave.
9. Tutup katup pengeluaran uap.
10. Amati kenaikan temperature dan tekanan.
11. Setelah tekanan mencapai 15 psi dengan suhu 121oC, api kompor dikecilkan.
12. Jaga keadaan tekanan 15 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Sampai pada suhu 126 oC matikan api kompor. Selama sterilisasi jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan hal lain diruang lain karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat.
13. Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up
14. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi media.

VI. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

1. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan antara lain Murashige dan Skoog (MS), Linsmaier dan Skoog (LS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dan lain-lain.
2. Media yang banyak digunakan dan media yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah media Murashige dan Skoog (MS).
3. pembuatan media harus memerhatikan pH yang terkandung dalam media, karena pH berpengaruh kepada sifat media.

B. Saran

Sebaiknya dalam pembuatan media tidak hanya membuat media MS saja walaupun banyak digunakan. Lebih baik mencoba media lain supaya lebih banyak pelajaran.

About these ads

Berikan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s